A molekuláris genetikai kutatási módszer

Ahhoz, hogy vizsgálja meg, és azonosítani variánsok DNS szerkezete használt molekuláris genetikai módszerrel. Minden egyes DNS-régió, amely feltárja ezt a régiót a kromoszóma, gén vagy alléi, a módszerek különböznek. Alapul az egyes molekuláris genetikai eljárás magában foglalja néhány vagy más manipuláció RNS és DNS. Mindezek a módszerek jellemzik hatalmas komplexitás nélkül laboratóriumi körülmények között nem lehet elvégezni, és a személyzet kell a magasan képzett. Ez munkát végeznek több lépésben.

szakaszában

Először is, RNS-t vagy DNS-mintákat kell előállítani. Itt, a molekuláris genetikai módszert lehet alkalmazni, hogy gyakorlatilag bármilyen anyag: egy csepp vér, leukociták, fibroblasztok kultúra, nyálkahártya (kapart), még a szőrtüszők, - DNS lehet bármilyen mintából nyerhetők. Ez alkalmas arra, hogy használja a molekuláris genetikai módszerek és a különböző lehetőségeket, és már régóta izolált DNS fagyasztva tároljuk. A második szakaszban elkötelezett a felhalmozódása a kívánt fragmensek (amplifikáció) DNS, mivel elősegíti a polimeráz-lánc-reakció in vitro (in vitro bevonása nélkül élő szervezet). Ennek eredményeként, a kiválasztott DNS-fragmens szoroz Ez a láncreakció, és a DNS mennyisége növekszik szó millió alkalommal.

A harmadik lépés a molekuláris genetikai kutatási módszerek feltételezzük sokszorozódott DNS restrikciós (e fragmentáció, könnyezés vagy vágás). Korlátozás végzett elektroforézissel, poliakrilamid vagy agaróz gélen. Ez a molekuláris genetikai eljárás tanulmányozása DNS-fragmens lehetővé teszi mindenki számára, hogy egy bizonyos helyzetben a gélen. Ezután a gélt kezeljük etidium-bromiddal, amely képes kötődni a DNS, az ultraibolya fénnyel való besugárzást, akkor lehet megfigyelni lumineszcencia részeket. A molekuláris genetikai diagnosztikai módszerek különbözőek és sokrétűek, de az első két lépést közös minden. De ahhoz, hogy azonosítani DNS-fragmentumokat a gélt lehet színes, és még sok más létező módszereket.

faj

A legközvetlenebb és elterjedt módszerek kimutatására mycobacteriumok között lehetnek a fenti molekuláris genetikai DNS tanulási módszer. Ennek lényege, hogy annak érdekében, hogy azonosítsa a szkennelési láncú anyag, specifikus DNS-fragmensek a kórokozók. A molekuláris genetikai diagnosztikai technikák még nem rendelkezik hatékonyabb módon elismerni az ilyen betegségek, mint a tuberkulózis. A polimeráz láncreakció (PCR), akkor biztos lehet benne, hogy az eredeti DNS növeli a példányszámot egy millió alkalommal, hogy van, nem lesz erősítés, és ez jelenik meg az eredményeket. Az érzékenységi szintje nagyon magas - több mint kilencvenöt százalékát, amely a fő előnye ennek a módszernek.

A többi molekuláris-genetikai módszerek a kutatás hatékonyságának hozam több példányban szó megduplázódott, mivel ebben az esetben a kidolgozása mintát mutat egy konkrét oligonukleotid-szekvencia emelkedett 106-szor. Még a kultúra diagnózis tuberkulózis a légzőrendszer jelentősen csökkenti az érzékenységet. Ez az, amiért a modern orvostudomány alapul molekuláris genetikai diagnosztikai módszerek a tuberkulózis. A leírt módszer hatékony különösen ha a kórokozók nagy antigénváltozékonyság meghatározhatja, hogy más módon sokkal nehezebb - igényel speciális táptalajon és ápolása hosszú ideig. A biokémiai és molekuláris genetikai módszerek igen eltérő hatása az eredményeket.

diagnózis tuberkulózis

Marshall PCR diagnózisa tuberculosis leggyakrabban segítségével azokat a DNS szekvenciákat, amelyek specifikusak mind a négy típusú a betegség. E cél elérése érdekében gyakran használnak primerek észlelését szekvencia elemek (IS-986, IS-6110), mivel ezek az elemek jellemzik vándorló fajok a Mycobacterium tuberculosis és mindig jelen több példányban a genomban. Szintén DNS-extrakciót végezhetjük a tiszta tenyészeteket és Klinikai (köpet betegek) bármely más, alkalmas módszerrel. Például van Boom módszer, ahol a lízis puffert használunk alapul guanidin-tiocianát és szilícium-dioxid, mint a hordozó DNS-t. A betegek száma, amelyek különböznek a szegény bakteriológiai évről évre nő, és ezért a klinikai gyakorlatban létrehozott egy teljesen más szintű szervezet: molekuláris genetikai módszer tanulmányozása DNS óta játszik jelentős szerepet a diagnózist.

Ugyanakkor el kell ismernünk, hogy vannak hátrányai. A PCR módszer alkalmazása gyakran hoz rengeteg téves pozitív eredményeket, és az ok nem csak a technikai hibák, hanem a funkciók a módszer maga. Ezen kívül ezzel a módszerrel diagnózis életképességének meghatározására micobaktériumok amelyeket azonosítottak, ez egyszerűen lehetetlen. De ez a hátrány nem a legfontosabb. A molekuláris genetikai módszerek PCR diagnosztikai jár a szennyeződés kockázatát a mikobakteriális DNS-t. Minősítési követelmények az oka, hogy a PCR-laboratórium, amelyet kizárólag kemény, szükség három különböző helyszínen. A PCR-technika modern és nagyon összetett, felhasználását igényli a megfelelő berendezések és magas képzett személyzet.

bacterioscopy

Ha a diagnózis az elemzés eredményeit össze kell hasonlítani a többi adat: klinikai vizsgálat, radiográfiai, kenet mikroszkópos, termés, sőt adott válaszként kezelés nagyon fontos. Ebben a sorozatban, a PCR-vizsgálatok csak az egyik komponens. A kórokozó a korai diagnózis lehet a legegyszerűbb és leggyorsabb módszer - bakteriológiai.

A felhasznált fénymikroszkóp (színezés Ziehl-Neelsen) és a fluoreszcens (színezés fluorokrómok). Az előny a sebesség kenet az eredményeket. De hátránya joggal tekinthető a korlátozott kapacitás miatt alacsony érzékenységű. Azonban ez a módszer adja a WHO ajánlása a leggazdaságosabb és a föld felderítésére tuberkulózisos betegek. Kimutatása mycobacteriumok bakteriológiai módszer előrejelzési érték és a becsült mennyiségileg bakteriális kiválasztódását. Sokkal magabiztosabb foglalkozni vele molekuláris genetikai kutatási módszerek a tuberkulózis.

kultúrák

Jobb észlelése mycobacteria elismerik a kulturális tanulmányok. Vetés kórbonctani anyag készül belőle a tojás közeg: Mordovsky, Finn II LJ, és hasonlók. Referenciaalapok ellenállás mikobaktérium a gyógyszerekhez és közvetett bizonyítékok hatékonyságának számos mikobaktériumok és telepek in vitro, ha az alkalmazott kutatás módszere kultúra. Növelése a százalékos izolálása mycobaktériumok beoltás patológiás anyagot tartott több környezetben.

Igényeinek kielégítésére számos kulturális, kórokozó ideértve a támogatási és folyadékok. Ebben a rendszerben használt és automatizált mérési típus VANTES növekedést. Növények kell tartani inkubáció akár hét-nyolc hét. Ekkorra a növény a növekedés hiánya tekinthető negatív. A leghatékonyabb módja annak, hogy érzékeli a Mycobacterium tuberculosis fontolóra biológiai mintákban: diagnosztikai anyagok Infect tengerimalacokat, amelyek rendkívül érzékenyek a TB.

néhány számadat

Érdekes tanulmányi, amely megnyitotta PCR diagnosztikai vizsgálata volt az M. tuberculosis - látens fertőzést. A modern fogalma TB fertőzés azt sugallja, hogy ki száz ember, akik kapcsolatba kerültek M. tuberculosis, kilencven lehet, hogy fertőzött, de csak tíz közülük betegség aktív fejlesztés alatt áll. Mások TB immunitást, és mivel kilencven százaléka az esetek a fertőzés látens marad. Felismerni a minta, hogy segített a molekuláris genetikai módszerrel.

A genetikusok azt mondják, hogy ötven százaléka, akiknek növények kórbonctani anyag negatív volt, és a nyolcvan százaléka az emberek fertőzött M. tuberculosis, de folyékony nem radiológiai megnyilvánulásait betegség, PCR-pozitív válaszok kapott. Ez egy genetikai diagnosztikai eljárás segített azonosítani veszélyeztetett betegeknél PCR vizsgálatok, az eredmények a elemzések (mikroszkópia és kultúra) negatív volt, és a szubklinikai fertőzés M. tuberculosis jelen volt.

modern kutatás

Az Orosz Föderáció és bakteriológiai laboratóriumok használni gyorsított módszer abszolút koncentrációk: nitrát-reduktáz aktivitását a mycobaktériumok által tesztelt Griess-reagens. Anti-TB centerek egy módszert, amely lehetővé teszi, hogy meghatározza a gyógyszer-rezisztencia. Ez vetés folyékony közegben, ahol automatizált radiometrikus és fluoreszkáló számviteli rendszer mycobaktériumok növekedését. Egy ilyen elemzés gyorsan elvégezhető - akár két hétig.

Jelenleg, az új módszereket fejlesztenek: gyógyszer-rezisztencia a mycobaktériumok mérése a genotípus szintjén. Tanulmány a molekuláris mechanizmusainak rezisztencia gének és jelenlétét mutatja a mycobaktériumok. Ezek a gének rezisztenciával összefüggő bizonyos gyógyszerek. Például, Kása gének, Inha, katG ellenálló izoniazid, rpoB gén - rifampicin 16SP-RNS-génekben, és rpsL - sztreptomicin, emb1 - a etambutol, gyrA - Fluorokinolon, és így tovább.

mutációk

A modern diagnózis jelentősen növelte a molekuláris genetikai szinten módszer tanulmányozására DNS végezhetnek nagyszabású tanulmányok mutációk minden spektrumát. Most már tudjuk, hogy a leggyakoribb mutáció a 516, 526 és 531 kodon a rpoB gén és azonosította az ellenállás különböző gyógyszerek. Van egy egész sor módszerek gépelési mycobaktériumok segítségével nemcsak a hagyományos módszerek - biokémiai, biológiai és kulturális, hanem széles körben használják a modern molekuláris genetikai módszerekkel. Már vannak megfelelő, és a helyes diagnózis kimutatására szolgáló eljárás monogénes betegségek. Ezek alapján DNS-vizsgálatok a pontos területet egy adott gén. Ez általában egy összetett folyamat, időigényes és költséges, de az adatok által biztosított molekuláris genetikai vizsgálat, sokkal pontosabb és informatív, mint az adatokat minden egyéb elemzéseket.

Régóta ismert, hogy a DNS-t nem változik az egész élet a szervezet, hogy minden magvas sejt odnakova, és ez teszi lehetővé, hogy az elemzés a abszolút minden sejt a szervezetben, bármely szakaszában az egyedfejlődés. A sérült gén mutatható megjelenése előtt az első tünetek a teljes körű klinikai betegség, valamint az egészséges heterozigóta ember, de van egy gén mutációja. A molekuláris genetikai, öröklődő betegség diagnosztikai módszerek lehetővé teszik, hogy felfedje a (közvetlen megközelítését, a DNS-diagnosztika), valamint, hogy elemezze a szegregáció, a betegség a családban markerlókuszok DNS (genetikai polimorfizmus), amelyek szorosan kapcsolódnak a sérült gén (azaz a közvetett megközelítés DNS-diagnosztika). Közvetlenül vagy közvetve - bármilyen DNS diagnosztika alapul azonosítására szolgáló eljárásokat szigorúan meghatározott részét az emberi DNS-t.

direkt módszerekkel

A közvetlen módszerek DNS diagnózis, amikor a tettes gén örökletes betegség ismert, mint jól ismert, és típusú mutációi. Például, egy megfelelő közvetlen módszerek számos betegség. Ez a Huntington-chorea (mellék CTG-ismétlődések), fenilketonuria (R408W), cisztás fibrózis (delF508, nagy mutációk) és hasonlók. A fő előnye a direkt módszer egy teljes tulajdonú diagnosztikai pontosságot, és nincs szükség, hogy csinál egy DNS-elemzés a család többi tagja. Ha egy mutáció a megfelelő gén megtalálható, ami lehetővé teszi annak pontosan jóváhagyja a diagnózis, az öröklődés, genotípus meghatározás a többi terhelt család.

Másik előnye a közvetlen diagnózis tartják azonosítani heterozigóta hordozója rossz mutációk a rokonok és a szülők, akik meghaltak a betegségben. Ez különösen igaz a betegségek autoszomális recesszív. Hátrányai közvetlen módszerekkel is rendelkezésre állnak. Alkalmazzák őket, meg kell tudni, hogy pontosan lokalizálja a hibás gént, exon-intron szerkezete a spektruma és mutációi. Nem minden monogénes betegségek ma megkapta ezt az információt. Informativitást direkt módszerekkel nem tekinthető teljes, mert egy és ugyanaz a gén nagyszámú patológiás mutáció okozza öröklődő betegségek.

indirekt módszerek

Közvetett módszerek DNS diagnosztika használják egyáltalán, más esetekben, ha a sérült gén nem azonosították, de csak kromoszómán, vagy ha a vonal diagnózis nem ad az eredmény (ez történik, ha a gén összetett molekuláris szervezet vagy nagy mértékben, ha van egy csomó patológiás mutációk). Közvetett módszerek végzett szegregációs elemzés a polimorf markerek allélikus család. Markerek találtunk ugyanabban a kromoszómális régió vagy lókusz szorosan kapcsolódik a betegség, és képviseli deléciót vagy inszerciót, pont szubsztitúciók, ismétlődések, és azok polimorfia miatt a különböző sejtek mennyisége a blokk.

Legkényelmesebb közvetett diagnózis tekinthető mikroszatellit és miniszatellitfragmentumok polimorfizmusok, amelyek széles körben elterjedtek az emberi genomban. azok kifejezett értéke magas információtartalom, ha a kárt a genetikai távolság a marker és a gén nem túl nagy. Az utóbbi esetben a becslés pontossága határozza meg nagy mértékben a rekombinációs frekvencia közötti polimorf marker és a sérülésektől. Közvetett diagnosztikai módszerek is nyújtanak a kötelező előzetes lépésként allélgyakoriság a vizsgált populáció vizsgálatban a betegek és hordozók mutációk, valamint a szükségességét meghatározó valószínűsége rekombinációjának egyensúlyi és adhéziós markerek és a mutáns allélek.

más módszerek

Rövid szegmensek az RNS vagy DNS, valamint egyetlen gén alatt tesszük láthatóvá mikroszkópos vizsgálat nem, tehát, hogy azonosítani mutációk szükséges molekuláris genetikai diagnosztika. Van egy „Human Genome Project”, valamint más fejlődése a molekuláris genetika jelentősen bővült a lehetőségét, hogy a diagnózis örökletes betegségek - mind pre- és posztnatális. Ezek a módszerek korai felismerés, és egy predikciós poli- és monogénes betegségek, akiknek a bemutatkozó zajlik felnőttkorban. Sajnos, mivel a technikai képességek a molekuláris genetikai vizsgálatok néha túl etikai korlátai vannak beállítva kapcsolatban öröklés, különösen, ha a diagnózis serdülő- és gyermekkorban.

Szerkezeti és számbeli kromoszóma-rendellenességek a leggyakoribb okai a betegségek és a rák, és sok fejlődési. Kromoszómaaberrációt azonosítani kell, ami fontos a családi tanácsadás - felmérni az előrejelzés, valamint a reproduktív kockázatot a jövőben terhesség. Kromoszóma-vizsgálattal a „gold standard” genetikai diagnózis, de korlátozott. Csak a módszerek molekuláris genetikai analízis többre is képes, mert ott használt klónozási technológia alapú fluoreszcens jelzések képesek a magas érzékenységet, hogy azonosítsa finom kromoszóma változásokat, amelyek lehetetlen észlelni klasszikus citogenetikai vizsgálatok. Ezek a technikák egyre bővülő diagnosztikai lehetőségek, amikor megvizsgálta, gyermekek fejlődési fogyatékos, mentális retardáció, sok más örökletes betegségek.

megállapítások

Nagyon fontos az emberiség számára voltak a gén szerkezetének és funkciójának a tudás, típusú variabilitás, képes érzékelni örökletes betegségek, hogy történt fejlesztésével kapcsolatban a molekuláris genetika. A módszer célja, hogy a tanulmány a DNS-molekula -, és ha ez normális, és ha sérült. Előállítása dezoxiribonukleinsav szekvenciákat a nukleotidok (DNS) terjed szakaszosan kapó mintákat azonosítani az egyes fragmensek. Izolálása genomiális DNS-t a sejtekből, restrikciós (könnyezés), amplifikációs (klónozás), elektroforézissel a fragmensek (elválasztó az elektromos töltésük és molekulatömeg agaróz gél). Azonosítása specifikus fragmentumok felszínén található egy diszkrét csík.

Ezután bekerülni a jogszabály speciális szűrőket, amelyen keresztül áthalad az egyes fragmensek hibridizálással klónozott DNS-fragmentumok vagy szintetikus radioaktív próbákat egy vezérlő, amely egyenlő lesz az egyes vizsgálati minta. Ha változtatni a helyzetét, vagy hossza képest a szonda, ha egy új, fragmens vagy eltűnt - mindez arra utal, hogy a vizsgált gén ment keresztül átalakítása a nukleotid szekvencia. Nyolc alapvető technikákat a molekuláris genetikai vizsgálatok: szekvenálása (meghatározzuk a DNS-szekvencia), polimeráz-láncreakció (növekedés a szekvenciák száma), a készítmény a primerek ismert gének, DNS klónozás, rekombináns molekulák eredetű fehérjék miatt rekombináns molekulák, ami egy teljes készlet (gyűjtemény könyvtár) klónozott fragmensek, hogy alkalmazásával kaptuk restrikciós.